产品货号：
YTB4155
中文名称：
小RNA连接试剂盒(含接头)
英文名称：
Small RNA 3'-Linker(5'adenylated, 3'blocked)and Ligation Kit
产品规格：
20T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种提供了5'腺苷化和3'封闭的Universal miRNA Cloning Linker及相应的连接酶和配套试剂，用于miRNA等3'端为羟基的小RNA和接头连接的试剂盒。3'端连接了接头的小RNA后续可以用于其克隆、高通量测序建库或PCR检测等。本试剂盒也可以用于3'端为羟基的单链DNA和接头的连接。
本试剂盒提供的Universal miRNA Cloning Linker，其5′端腺苷酰化(也称5'端预腺苷酰化或5'端预腺苷化，5'pre-adenylated或5'pre-adenylation)，3'端氨基封闭，可以用于3'端为羟基的RNA的3'端接头的添加。本试剂盒中提供的T4 RNA连接酶II截短型(T4 Rnl2,truncated)可以识别“活化”的5'端腺苷酰化的Universal miRNA Cloning Linker，在无需ATP存在的条件下，可将Universal miRNA Cloning Linker的5′端与另外一条单链寡核苷酸的3'端羟基共价连接。
使用本试剂盒和miRNA连接时，可以有效避免miRNA的自连、不同miRNA之间的连接、Linker的环化或Linker分子之间的连接，而仅发生Linker 5'端和miRNA 3'羟基之间的特异性连接。
本试剂盒提供的Universal miRNA Cloning Linker的序列是：5'-rAppCTGTAGGCACCATCAAT-NH2-3'。
图1.本试剂盒催化连接Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)和ssRNA的效果图。反应体系为20μL，Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)的终浓度为1μM，单链RNA的终浓度为0.5μM，反应条件为25℃孵育60min，反应完毕后立即取样在65℃孵育20min终止反应，加入变性上样缓冲液并在95℃孵育5min后放至冰浴中，随后用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本试剂盒催化连接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效率非常高。
| 组分 | 规格 |
| Universal miRNA Cloning Linker (6.9μM) | 29μL |
| DEPC-treated Water | 100μL |
| PEG8000 (50%,RNase-free) | 300μL |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 20μL |
| T4 Rnl2tr(200U/μL) | 20μL |
| 10×T4 Rnl2tr Buffer | 50μL |
保存：-20℃，有效期1年。
本试剂盒如果用于20μL的反应体系，并按照本试剂盒推荐的连接体系，可以用于20次的Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的连接反应。
- 本试剂盒附带提供的试剂均用DEPC水配制，可直接用于底物为单链RNA (3'端需为羟基)和Universal miRNA Cloning Linker (5'adenylated,3' blocked)的连接反应。
- 使用本试剂盒连接ssRNA和Universal miRNA Cloning Linker (5'adenylated,3'blocked)时，建议使用的PEG8000的浓度为10%～30%，适当提高PEG8000的浓度，会显著提高连接效率。
- 用于连接Universal miRNA Cloning Linker和单链RNA(ssRNA)的3'羟基末端时，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
成分 用量 终浓度 ssRNA xμL 0.5μM DEPC-treated Water (2.55-x)μL - Universal miRNA Cloning Linker(6.9μM) 1.45μL 0.5μM PEG8000(50%,RNase-free) 12μL 30% 10×T4 Rnl2tr Buffer 2μL 1× RNase Inhibitor(40U/μL) 1μL 2U/μL T4 Rnl2tr(200U/μL) 1μL - 总体积 20μL - - 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase inhibitor，以避免ssRNA或其连接产物的降解，尽管经测试我们发现在严格操作的情况下，不加RNase inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
- 进行连接反应时，通常推荐ssRNA和linker按照1:1进行连接反应，以适当节约本试剂盒。如果样品RNA比较珍贵，希望充分被连接，可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接；如果样品RNA比较充裕，同时感觉本试剂盒的成本偏高时，可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应，这样可以很好地节省本试剂盒。
- 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
- 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase inhibitor，以避免ssRNA或其连接产物的降解，尽管经测试我们发现在严格操作的情况下，不加RNase inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
- 连接反应：25℃，孵育60min。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
- 终止反应：65℃，孵育20min。
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